脾臟組織消化手冊(cè)

更新時(shí)間：2016-02-16

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Worthington組織消化指南

引言

組織消化酶主要用于組織培養(yǎng)和細(xì)胞生物學(xué)研究的原代細(xì)胞的分離和收集。盡管這些消化酶已經(jīng)普遍應(yīng)用多年，但是對(duì)其組織消化和細(xì)胞收集的作用機(jī)制卻沒有全面的理解。由此導(dǎo)致的結(jié)果便是選擇一種消化方法大多是隨機(jī)選擇或基于過去的經(jīng)驗(yàn)，而不是在*理解消化原理的基礎(chǔ)上選擇的消化方案，以及如何根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康男拚桨敢垣@得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

細(xì)胞分離程序的目的是zui大程度的獲得功能活性的單個(gè)細(xì)胞，而影響結(jié)果的原因有很多，包括（不限于）以下：

1、組織類型

2、物種來源

3、動(dòng)物年齡

4、遺傳改造情況（如knockouts）

5、所用的消化培養(yǎng)液

6、所用的酶

7、消化酶中的雜質(zhì)

8、所用消化酶的工作濃度

9、溫度

10、孵育時(shí)間

通常前四個(gè)原因沒辦法選擇，而剩下的原因一般由經(jīng)驗(yàn)決定以獲取zui適實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

通過查閱文獻(xiàn)來選擇*組織消化酶和zui適消化條件的研究人員通常被互相矛盾的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)搞得一頭霧水。這些巨大差異來源于組織胞外基質(zhì)的復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的特性，以及過去常用的粗制、未提純的組織分離酶。另外，組織胞外基質(zhì)由各種蛋白、糖蛋白、脂類和糖脂組成，這些成分的組成比例在不同物種、不同組織、甚至不同發(fā)育（年齡）之間存在明顯的差異，這些因素都極大的影響了消化方案的制定。目前通常使用的粗制酶，如鏈霉蛋白酶、NF1:250、以及含有幾種其他不同濃度蛋白酶的膠原酶、以及各種多糖酶、核酶和脂酶。

本指南總結(jié)了目前常用組織消化酶的zui適消化和細(xì)胞收集知識(shí)和方法，描述了標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)步驟，以便于制定一個(gè)*的細(xì)胞分離方案，同時(shí)列舉了一些相關(guān)的參考文獻(xiàn)。

下表列出多種組織的適宜消化酶（含參考文獻(xiàn)，以組織類型和物種分類，詳見鏈接）

脂肪組織	腎上腺組織	骨組織	腦組織
軟骨組織	結(jié)腸組織	內(nèi)皮組織	上皮組織
眼	心臟	腸	腎
肝	肺	淋巴結(jié)	乳腺
其它組織	其他組織	肌組織	神經(jīng)組織
胰腺	腮腺	垂體	前列腺
生殖	動(dòng)物鱗片	皮膚	脾臟
干細(xì)胞	胸腺	甲狀腺/甲狀旁腺	扁桃體
腫瘤

注：使用Worthington公司消化酶的文獻(xiàn)不限于上表鏈接中所列，一般而言，Worthington公司的組織消化酶可用于大多組織類型的消化。

脾臟組織消化手冊(cè)

物種	詳細(xì)來源	細(xì)胞名稱	消化用酶	培養(yǎng)基	參考文獻(xiàn)
小鼠	小鼠	Splenic	Collagenase Type 2: 0.1%	PBS	Klebanoff, C., Spencer, S., Torabi-Parizi, P., Grainger, J., Roychoudhuri, R., Ji, Y., Sukumar, M., Muranski, P., Scott, C., Hall, J., Ferreyra, G., Leonardi, A., Borman, Z. et al.: Retinoic Acid Controls the Homeostasis of Pre-cDC-Derived Splenic and Intestinal Dendritic Cells., J Exp Med 210, 1961, 2013
小鼠	小鼠	Splenocytes	Collagenase Type 2: 0.16%	PBS	Yi, T. and Cyster, J.: EBI2-Mediated Bridging Channel Positioning Supports Splenic Dendritic Cell Homeostasis and Particulate Antigen Capture.,Elife Vol. 2,, , e00757, 2013
			Deoxyribonuclease I: 0.002%
小鼠	小鼠	Spleen, bone marrow endothelial	Collagenase Type 4: 0.3-1.0%	PBS	Shi, C., Jia, T., Mendez-Ferrer, S., Hohl, T., Serbina, N., Lipuma, L., Leiner, I., Li, M., Frenette, P. and Pamer, E.: Bone Marrow Mesenchymal Stem and Progenitor Cells Induce Monocyte Emigration in Response to Circulating Toll-Like Receptor Ligands., Immunity 34, 590, 2011
			Deoxyribonuclease I: 20 u/ml
小鼠	小鼠, 雌性, 6-8 week	Dendritic	Collagenase Type 4: 0.05%	RPMI 1640	Abou Fakher, F., Rachinel, N., Klimczak, M., Louis, J. and Doyen, N.: TLR9-Dependent Activation of Dendritic Cells by DNA from Leishmania Major Favors Th1 Cell Development and the Resolution of Lesions., J Immunol 182, 1386, 2009
小鼠	小鼠	Dendritic	Collagenase Type 1: 0.5%	HBSS	Flano, E., Jewell, N., Durbin, R. and Durbin, J.: Methods Used to Study Respiratory Virus Infection.,Curr Protoc Cell Biol Vol. Chapter 26,, , Unit 26.3, 2009
小鼠	小鼠	Dentritic	Collagenase: 300 u/ml	RPMI 1640	Abe, K., Nguyen, K., Fine, S., Mo, J., Shen, C., Shenouda, S., Corr, M., Jung, S., Lee, J., Eckmann, L. and Raz, E.: Conventional Dendritic Cells Regulate the Outcome of Colonic Inflammation Independently of T Cells., Proc Natl Acad Sci U S A 104, 17022, 2007
			Deoxyribonuclease I: 0.002%
小鼠	小鼠	Splenic	Collagenase Type 2: 0.1%	RPMI	Mueller, S., Matloubian, M., Clemens, D, Sharpe, A., Freeman, G., Gangappa, S., Larsen, C. and Ahmed, R.: Viral Targeting of Fibroblastic Reticular Cells Contributes to Immunosuppression and Persistence During Chronic Infection., Proc Natl Acad Sci U S A 104, 15430, 2007
			Deoxyribonuclease I: 0.1%
小鼠	小鼠	Splenic stromal	Collagenase Type 3: 100-400 u/ml	HBSS	Benedict Chris A, De Trez Carl, Schneider Kirsten, Ha Sukwon, Patterson Ginelle, Ware Carl F:Specific remodeling of splenic architecture by cytomegalovirus, PLoS Pathog 2, e16, 2006
小鼠	小鼠	Leukocytes	Collagenase Type 4: 43 u/ml	RPMI 1640	Siragam, V., Crow, A., Brinc, D., Song, S., Freedman, J. and Lazarus, A.: Intravenous Immunoglobulin Ameliorates ITP via Activating Fc Gamma Receptors on Dendritic Cells., Nat Med 12, 688, 2006
小鼠	小鼠, 4-6 周	Dentritic	Collagenase Type 1: 0.1%	RPMI-1640	McLellan AlexanderD, Kapp Michaela, Eggert Andreas, Linden Christian, Bommhardt Ursula, Br枚cker Eva-B, K盲mmerer Ulrike, K盲mpgen Eckhart: Anatomic location and T-cell stimulatory functions of mouse dendritic cell subsets defined by CD4 and CD8 expression, Blood 99, 2084-93, 2002
			Deoxyribonuclease I: 0.001%
小鼠	小鼠	Dentritic	Collagenase Type 3: 0.1%	RPMI 1640	Schiavoni, F, Mattei, F, Sestili, P, Borghi, P, Venditti, M, Morse, H, Belardelli, F, and Gabrieli, L:ICSBP is Essential for the Development of Mouse Type I Interferon-producing Cells and for the Generation and Activation of CD8a+ Dendritic Cells, J Exp Med 196, 1415, 2002
			Deoxyribonuclease I: 325 u/ml
小鼠	小鼠	Dentritic	Collagenase: 100 u/ml	HBSS	Brasel K, De Smedt T, Smith JL, Maliszewski CR: Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures, Blood 96, 3029-39, 2000

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