熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶(HL-SAN)說明書

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產(chǎn)品詳情  

產(chǎn)品詳情

無論是實(shí)驗室規(guī)模樣品制備、還是生產(chǎn)規(guī)模工藝過程，去除核酸都可以改善工藝流程，如蛋白純化、病毒載體制備、mNGS中樣品處理等過程。而核酸酶的選擇，就顯得特別重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶，HL-SAN) 是一種非特異性內(nèi)切酶，在高鹽濃度下具有最佳活性；且該酶在多種緩沖液中都有活性，很容易通過還原劑處理而失活。這些特性使HL-SAN在需要去除DNA和RNA的應(yīng)用中，更為適合。

核酸污染，特別是宿主基因組DNA污染，在幾乎所有工藝流程及生物制品的生產(chǎn)中，都是需要重點(diǎn)解決的問題。一方面，宿主DNA的存在，影響目標(biāo)產(chǎn)物的純化及下游質(zhì)量分析等。另一方面，宿主DNA殘留能引起機(jī)體嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，是生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)之一，F(xiàn)DA及NMPA等對Host Cell DNA (HCD)有嚴(yán)格的質(zhì)控要求。宿主基因組DNA中，組蛋白與DNA形成核小體，核小體緊密折疊形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的染色質(zhì)。組蛋白與DNA間存在強(qiáng)烈的離子作用及疏水作用，再加上特殊的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致宿主DNA很難被準(zhǔn)確檢測并清除。已有文獻(xiàn)表明，高鹽濃度下組蛋白與DNA解離相對容易，這有利于宿主DNA的檢測及去除。但市售的絕大多數(shù)核酸酶在高鹽濃度下活性很弱，甚至失活。而耐高鹽的HL-SAN成了這類應(yīng)用的理想選擇。

特點(diǎn)

高鹽條件下，DNA清除效率更高，宿主DNA殘留更少；

pI為9.6，容易跟絕大多數(shù)蛋白分離；

還原劑存在時，酶易失活，減少對后續(xù)流程的影響。

活性測定條件

圖 1：高鹽度溶液中的最佳活性。HL-SAN 在約 0.5 M NaCl 下具有最佳活性，但在 [NaCl] 和 [KCl] 的廣泛范圍內(nèi)運(yùn)行。HL-SAN 的活性在 25 mM Tris-HCl 緩沖液、pH 8.5、5 mM MgCl 2 和不同的 [NaCl] 或 [KCl] 中測試。最大活性設(shè)置為 100%。

圖 2：溫度和活動。HL-SAN 在 ~35°C 時具有最佳活性，但在很寬的溫度范圍內(nèi)起作用（10°C 和 50°C 下的活性為 20%）。在含有 5 mM MgCl 2 和 0.5 M NaCl 的pH 8.5 的 25 mM Tris-HCl 緩沖液中測試 HL-SAN 的活性。

圖 3： MgCl 2 和 MnCl 2 濃度對 HL-SAN 活性的影響。

在 25 mM Tris-HCl 緩沖液、pH 8.5、0.5 M NaCl 和不同濃度的 MgCl 2 或 MnCl 2 中測試 HL-SAN 的活性。將含有 5 mM MgCl 2的樣品的活性 設(shè)為 100%。

圖 4： HL-SAN 將 ssDNA 消化為 ~5-13 nt，將 dsDNA 消化為 ~5-7 nt。ssDNA 最終產(chǎn)物的大小從 ~5-13 nt 不等，而 dsDNA 被消化到大約 ~5-7 nt。最終產(chǎn)物的大小似乎取決于 DNA 序列。底物 1 和 2 是具有不同序列的 ssDNA，底物 3 和 4 是具有相似序列但在不同末端具有 FAM 標(biāo)記的 dsDNA。底物 5 是 dsDNA，其序列與底物 3 和 4 相同，但兩端帶有 FAM 標(biāo)記。

適用范圍

病原微生物檢測應(yīng)用，如宏基因組測序（mNGS）樣品去除宿主DNA；

蛋白純化，特別是DNA結(jié)合蛋白；

病毒載體制備，如腺相關(guān)病毒（AAV）、腺病毒（AdV）等；

其他需要去除宿主DNA的應(yīng)用等。

應(yīng)用舉例

1、Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection.

Charalampous T, Kay GL, Richardson H, Aydin A, Baldan R., Jeanes C, Rae D, Grundy S, Turner DJ, Wain J, Leggett RM, Livermore DM, O’Grady J.

Nature Biotechnology. 2019; 37: 783–792.

2、A Structured Workflow for Mapping Human Sin3 Histone Deacetylase Complex Interactions Using Halo-MudPIT Affinity-Purification Mass Spectrometry.

Banks CAS, Thornton JL, Eubanks CG, Adams MK, Miah S, Boanca G, Liu X, Katt M, Parmely T, Florens LA, Washburn MP.

Molecular & Cellular Proteomics. 2018; 17 (7): 1432-1447.

3、Biochemical characterization of ParI, an orphan C5-DNA methyltransferase from Psychrobacter arcticus 273-4.

Grgic M, Williamson A, Kjaereng Bjerga GE, Altermark B, Leiros I.

Protein Expr Purif. 2018; 150: 100-108.

4、Biochemical Characterization of a Family 15 Carbohydrate Esterase from a Bacterial Marine Arctic Metagenome.

De Santi C, Willassen NP, Williamson A.

PLoS ONE. 2016; 11(7): e0159345.

5、Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibrio salmonicida.

Williamson A, Pedersen H.

Protein Expr Purif. 2014; 97: 29-36.

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作！

本產(chǎn)品主要用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

質(zhì)量控制

來源：在畢赤酵母中重組生產(chǎn)。

活性：HL-SAN在10-50°C的溫度范圍內(nèi)具有高活性。 活動的最佳 NaCl 濃度為 0.5 M，工作范圍為 0.25–1 M。活動需要 Mg2+ (>1 mM)。 工作 pH 范圍為 7.5-9.5，最佳 pH 值為 9.0。

比活度：≥ 175 000 Units/mg。

單位定義：一個單位定義為在 37°C 下 30 分鐘內(nèi) 1 A 在 260 nm 處的吸光度增加，使用 50 μg/ml 小牛胸腺 DNA（D-1501，Sigma）在由 25 mM Tris-組成的緩沖液中 HCl，pH 8.5 (25°C)，5 mM MgCl2，500 mM NaCl。