paratechs 50010說明書
 

Nitrate Reductor Kit 50010
 

　　50010
 

　　該設備可用于使用單個一次性微孔板分析生理液中的硝酸鹽作為亞硝酸鹽，用于還原過程和 Griess 反應比色測定。Reductor 在涉及體內一氧化氮產生的生物醫學研究中具有廣泛的應用。
 

　　該設備還應用于農業研究、土壤測試和環境監測。
 

　　昂貴的一次性硝酸鹽分析套件被可重復使用的設備取代，適用于分析數千個樣品。
 

　　常規執行 ELISA 測試程序的實驗室應該已經擁有必要的設備和用品，并且只需要購買 Reductor 即可獲得比幾乎任何其他分析系統更有效地執行硝酸鹽分析的能力。
 

　　幾乎可以在任何樣品基質中成功分析硝酸鹽。
 

　　引用出版物中描述的標準添加方法協議允許在一次操作中準確建立水標準與統計得出的樣品濃度的關系。因此可以很容易地確定對給定矩陣的方法的絕對準確度的評估。
 

　　使用其他市售硝酸鹽分析套件時，每次分析的費用從幾美元減少到使用 ParaTechs Reductor 時只需幾美分。
 

　　不再需要昂貴的專用儀器，例如連續流分析儀。除了準確的移液技能外，執行分析只需要很少的專業知識。
 

　　減速器沒有活動部件，分析不需要啟動時間。試劑制備簡單，可長期穩定使用。
 

　　使用多個還原器，用于硝酸鹽分析的每日實驗室吞吐量僅受應用于該任務的個人數量的限制。
 

　　硝酸鹽還原劑說明
 

　　有可能的使用
 

　　ParaTechs Nitrate Reductor 旨在促進對各種樣品基質中的硝酸鹽進行分析，包括血清、尿液、天然水以及土壤和植物組織的提取物。該裝置由 96 個單獨的鍍銅鎘針組成，用于在一次性微孔板的所有孔中同時將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。還原完成后，加入 Griess 試劑，并使用酶標儀進行最終比色測定。
 

　　需要分析儀器
 

　　可調諧酶標儀(或帶有 540 nm 濾光片的儀器)；超聲波清洗機；滴定板搖床；單道和多道移液器；酸堿度計；渦流混合器。當使用集束管 (Fisher Scientific) 制備樣品進行分析時，離心機(例如，帶有 A-2-DWP 轉子的 Eppendorf 5810 型)對于某些應用也是不可少的。
 

　　重要的
 

　　ParaTechs Nitrate Reductor 用作一組 Cu-Cd 微型電池，具有將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽所需的電壓。然而，在鍍銅過程中，Reductor 將無法正常工作，并且使用高濃度硝酸鹽激活以增加反應表面積已成功完成。每個新的 Reductor 都在我們的實驗室進行了部分預處理，但仍 必須在酸性清潔溶液中超聲處理 2 分鐘，然后在進行校準檢查之前用高濃度的硝酸鹽進一步活化 (見下文)。初始調節后，隨著銅涂層變得更加穩定，還原劑的性能將有所提高。然而， 每次使用 Reductor 時都必須執行 60 秒的超聲處理步驟。  鎘針上的活性還原位點將被氧化鎘阻塞，因為在每次使用后讓還原劑干燥。
 

　　處理
 

　　Reductor 可重復用于數千個樣品，而不會顯著降低效率。多次使用 (40-60+) 后，鎘針會在液-氣界面處被腐蝕，并且針可能會在超聲波清洗過程中開始折斷。 建議在每次銷售時購買兩個減速器，以便始終提供備用設備. 還原器已在我們的實驗室進行了預處理，但是，在首使用之前，必須在硫酸銅的鹽酸溶液(2 mL 2.0% CuSO4/175 mL 1.0 M HCl)中超聲處理 2 分鐘以激活還原器。該溶液可以裝在提供的可密封塑料盒中，該塑料盒裝在超聲波清潔器內。激活過程用于增加減速器引腳的反應表面積并啟動鍍銅過程。超聲處理后，Reductor 用 DI 水沖洗，用紙巾擦干，然后安裝到含有 20 µL 200 µg/ml 硝酸鹽-N 溶液和 200 µL 標準 pH 8.5 氯化銨緩沖溶液的微孔板上(見下文)。然后將該組件搖動一小時。下一個，用 DI 水*沖洗 Reductor，然后放回酸洗溶液中 60 秒。最后，將還原器沖洗干凈，吸干水分，然后放入提供的包含 pH 8.5 氯化銨緩沖液的托盤 (Nunc Omintray) 中。然后執行校準檢查。
 

　　校準檢查
 

　　在開始實際樣品分析之前，應驗證每個新 Reductor 的精度。在歸約過程中，所有引腳的行為都應相同。應使用基本分析程序(如下所述)分析 96 份相同標準溶液(即 5.0 µg/mL NO3-N)。所有產生的光密度都應在移液誤差范圍內(即 ±3%)。  注意：當使用多道移液器添加標準溶液時，吸頭組應在使用前潤濕并至少更換兩次，以避免引入移液錯誤。
 

　　分析前樣品制備
 

　　可以使用 Reductor 分析具有簡單基質(例如天然水或土壤的氯化甲提取物)的樣品，而無需考慮樣品制備。只需將校準標準的基質與樣品基質匹配并提供足夠的還原時間。然而，在分析具有復雜基質的樣品時，不可能與水標準品進行密切匹配。例如，生理液體和一些含有低水平硝酸鹽的植物組織提取物不能被充分稀釋以抵消基質成分對還原過程的影響，或在還原成亞硝酸鹽完成后對格里斯反應化學的影響。因此，需要在開始分析之前盡可能地去除這些物質。Somogyi試劑(NaOH/ZnSO4)的使用，如下所述，可能有助于緩解此問題。在說明末尾的參考資料中可以找到對這些問題的更完整討論。
 

　　分析試劑 (有關具體制備說明，請參閱下面的參考資料。)
 

　　1. 酸洗溶液 2 mL 2% CuSO4·5H2O 的 175 mL 1M HCl。
 

　　2. 1% NH4Cl 緩沖液 pH 8.5。
 

　　3. 1% NH4Cl 緩沖液，pH 10.0。
 

　　4. Griess 試劑庫存#1。去離子水中的 0.1% N(1-萘基) 乙二胺2鹽酸鹽 (NED)。
 

　　5. Griess 試劑庫存#2。1.0% 磺胺的 3M HCl 溶液。
 

　　6. Griess 試劑庫存#3。1.0% 磺胺的 6M HCl 溶液。
 

　　7. Somogyi 試劑溶液#1。0.300M NaOH。
 

　　8. Somogyi 試劑溶液#2。5.00% w/v 的 ZnSO4·7H2O 在 DI 水中的溶液。
 

　　9. 經認證的 1000 mg/L NO3-N 儲備溶液(Fisher Scientific)。
 

　　基本分析程序
 

　　1.  每次使用Reducor都必須執行此步驟。 Reductor 用 DI 水沖洗，放入酸洗液中，超聲處理約 60 秒以去除表面氧化。
 

　　2. 然后用 DI 水沖洗 Reductor，并在紙巾上吸干。此外，在分析過程中，附著在設備底部的任何液體都可能會滲入樣品中，因此必須使用 Q-tip 或折疊紙巾將其清除。然后將該裝置放置在包含標準 pH 8.5 氯化銨緩沖溶液的托盤 (Nunc Omnitray) 中，小心僅將針浸沒，同時保持底部干燥。
 

　　3. 對于水樣或土壤的 KCl 提取物，在樣品基質中制備標準品。20 µL 等分試樣通常會產生 0-5 µg/mL NO3-N 范圍內的線性校準曲線。但是，可以根據需要通過改變等分體積來調整范圍。
 

　　4. 開始分析時，通常將 20 µL 等份樣品移液到微孔板 (Nunc) 中，然后加入 200 µL pH 8.5 氯化銨緩沖液。
 

　　5. 將微孔板放在滴定板振蕩器上。將 Reductor 從托盤中提起，在紙巾上吸干，并用鎖定銷固定在微孔板上。調整搖床速度設置，使不會發生溢出(即 6.5)。然后通過搖晃約 60 分鐘將硝酸鹽定量還原為亞硝酸鹽。
 

　　6. 當樣品搖晃時，Griess 試劑可以通過混合等體積的儲備溶液#1 和#2 來制備。
 

　　7. 振蕩間隔后，將 Reductor 從微孔板中提起并用 DI 水*沖洗。如果要立即重新使用 Reductor，則可以重復清潔和重新激活程序。否則，應讓減速器在紙巾上晾干。
 

　　8. 然后將 60 µL 混合的 Griess 試劑加入到含有樣品和校準標準品的微孔板中，并置于滴定板振蕩器上 5 分鐘以完成顯色。
 

　　9. 最后，通過在酶標儀上測定樣品和標準品在 542 nm 處的光密度來完成分析。
 

　　使用 Somogyi 試劑修改樣品基質
 

　　對于血清、尿液或高度著色的植物組織提取物等基質復雜的樣品，可使用 Somogyi 試劑(NaOH/ZnSO4)與 Zn(OH)2 共沉淀，消除樣品基質中的許多干擾物質。對基本程序的進一步修改，例如將還原過程中使用的緩沖溶液的 pH 值提高到 10.0，以及增加混合 Griess 試劑中的磺胺濃度，也將有助于減少干擾。有關使用標準添加方法的程序驗證協議的討論，請參閱參考資料。
 

　　1. 如果有配備合適轉子的離心機(見上文)，使用 1.2 mL 集束管進行分析前基質修飾是有效的。首先，將適當數量的空管放置在集束管架中；然后將 300 µL Somogyi Reagent Solution #1 (0.300 M NaOH) 添加到每個試管中。接下來，添加 150 µL 樣品，并通過將液體吸回移液器吸頭并排出至少兩次來與 NaOH 混合。然后使用單通道移液器添加 300 µL Somogyi 試劑溶液 #2(5.00% w/v 的 ZnSO4·7H2O 的去離子水溶液)，并立即渦旋每個簇管。這建立了 5 的稀釋系數。
 

　　2. 將裝滿的簇管架置于冰箱或冰浴中 10 分鐘，讓共沉淀反應發生。然后將簇管架組件以 3700 rpm(最大速度)離心 20 分鐘。得到的上清液應該是透明的，沒有硝酸鹽的損失。
 

　　3. 校準標樣在適當范圍內的去離子水中制備。對于血清，典型的操作范圍是 0-2 µg/mL NO3-N(即 0-143 µM)。將處理過的血清樣品和校準標準品的 50 µL 等分試樣移液到 Nunc 微孔板中，并添加 170 µL pH 10 氯化銨緩沖液。
 

　　4. 與 pH 10 的氯化銨緩沖系統一起使用的 Griess 試劑是通過將 5 mL 等分的儲備溶液 #1 和 #3 添加到預先稱重的 200 mg 磺胺中來制備的。可以使用聲處理來溶解固體。
 

　　5. 還原過程和最終的比色分析如前所述使用 60 分鐘的還原時間進行。
 

　　煙草植物組織硝酸鹽分析特別說明
 

　　煙草植物含有(也許)數百種可溶性化合物，這些化合物可能在接近中性的 pH 值下與亞硝酸鹽發生反應。這提出了所有使用鎘還原的硝酸鹽分析技術的共同問題。ParaTechs 鎘還原劑在分析過程中將硝酸鹽 (NO3) 還原為亞硝酸鹽 (NO2)，然后這種 NO2 可能與煙草中發現的可溶性化學物質反應形成不會產生顏色響應的化合物，因此不會測量 NO2 . 可以通過將氯化銨 (NH4Cl) 緩沖液的 pH 從 8.5 提高到 10.0 來最小化這個問題。在較高的 pH 值下，亞硝酸鹽的反應性較低，因此在還原劑就位時，大部分 NO2 是穩定的。然而，一旦加入 Greiss 試劑，pH 就會降至 0 以下。
 

　　Greiss 反應分兩個階段進行。在第一階段，NO2 與磺胺反應，然后該中間產物與 0.1% N-(1-萘基)乙二胺2鹽酸鹽 (NE) 試劑反應形成顏色響應。在分析煙草組織(和其他植物組織)時，我們建議在混合顯色試劑中添加超出通常推薦量的額外磺胺。這增加了 NO2 離子在與一些其他化合物發生反應之前遇到磺胺的統計概率。通常，我們在 10 mL 混合 Greiss 試劑中稱重 200 mg 額外的磺胺。這導致溶液接近飽和，并且已發現顯著增加計算的硝酸鹽水平。請注意，要使用的磺胺原液是用 6 N HCl 而不是 3 N HCL 配制的。
 

　　附加信息
 

　　Nitrate Reductor 套件不包括超聲波清潔器。我們發現“Gemoro 1.2 Quart Ultrasonic Cleaner”品牌是用于在兩次使用之間清潔減速器的有效儀器，并且與提供的酸洗溶液容器兼容。